J. Belmonte y J.M. Roure

Mètodes de mostreig aerobiològic

Molts investigadors han treballat en el disseny d'aparells mostrejadors de l'atmosfera, anomenats també captadors, amb fins aerobiològics. En el text que segueix no es pretén fer un estudi exhaustiu de tots ells, però sí una breu presentació dels principis en que es basen i dels mètodes que més s'han utilitzat ^(1,2) per a estudiar els pòl·lens i les espores de fongs aerovagants. La taula 1 conté un esquema dels diferents tipus de captadors.

Taula 1. Resum dels diferents mètodes de mostreig aerobiològic.

Els primers captadors utilitzats es basaven en el principi de la gravetat i consistien en superfícies preparades amb substàncies adhesives o retentives, exposades horitzontalment. A començaments del segle XX s'usaven plaques de Petri ⁽³⁾, coixinets compactes de molses ⁽⁴⁾ i portaobjectes ⁽⁵⁾; posteriorment es varen idear suports més adients, naixent així els captadors Durham ⁽⁶⁾ i Tauber ⁽⁷⁾. També Cour ⁽⁸⁾ completava el seu captador (vegeu més endavant) amb filtres horitzontals. Aquest tipus de mostreig permet un bon coneixement de la qualitat i diversitat de les partícules, però només permeten quantificar-les per unitat de superfície.
Buscant fer més comprensibles els resultats, es varen idear captadors que mesuren els pòl·lens per unitat de volum d'aire. Donat que les partícules són transportades per l'aire en trajectòries que poden considerar-se horitzontals, s'han dissenyat captadors que, aprofitant la inèrcia de les partícules, propicien l'impacte d'aquestes en superfícies untades amb substàncies adhesives, que les retindran.

Són molt abundants els mostrejadors que es basen en el principi de l'impacte per succió mitjançant una bomba de vuit, que impulsa l'aire aspirat contra la superfície receptora. El captador d'aquest tipus més universalment utilitzat fou l'ideat per Hirst ⁽⁹⁾ (s'explica detingudament més endavant), encara que també són molt utilitzats una variant dels inicials captadors per succió que s'anomena captadores en cascada ⁽¹⁰⁾. En aquest cas, l'aire succionat cap a l'interior del captador passa a través d'una o més superfícies receptores que retindran selectivament les partícules en funció de la mida de les mateixes.

Hi ha encara un altre tipus de captadors per impacte, els basats en la rotació. El més conegut en aquest grup és el Rotorod ⁽¹¹⁾. Aquest captador, de reduïdes dimensions, disposa de dos braços en forma de U en els que s' insereixen les superfícies receptores. Al girar a gran velocitat per acció d'un motor, intercepten les partícules. Aquest tipus de captador és àmpliament usat a Amèrica del Nord. Altres mostrejadors d'aquest grup, menys coneguts, són els ciclònics. En ells, les masses d'aire són forçades a moure's en trajectòries de rotació o en espiral i les partícules resulten discriminades per la força centrífuga generada. Els captadors basats en impacte per rotació són útils per a recol·lectar partícules d'uns 10 micròmetres de diàmetre ⁽²⁾.

Un altre grup de captadors el constitueixen aquells que funcionen per filtració, ja sigui a través de membranes de materials diversos o a través de fibres, com és el cas del Captador Cour ⁽⁸⁾ (s'explica detingudament més endavant). Els captadors per filtres de membranes són usats majoritàriament en la captura de partícules no biològiques, excepte una modificació d'ells, el CAP ⁽¹²⁾, dissenyat especialment per a pòl·lens i espores.
Poden citar-se altres mètodes, com els d'impregnació en medi líquid (per a partícules viables), precipitació electrostàtica i precipitació tèrmica.

D'entre tots els captadors presentats fins ara, els més utilitzats a Europa en estudis destinats a conèixer la composició en pòl·lens i espores de l'atmosfera són el Cour ⁽⁸⁾ i, molt especialment, el Hirst ⁽⁹⁾.

Un captador Cour ⁽⁸⁾ (vegeu figura 1 ) és un mostrejador per filtració que consisteix en un eix perpendicular al sòl, que sosté, encaixat en el seu extrem superior, un eix perpendicular capaç de girar 360º. En un extrem d'aquest eix hi ha dos marcs protegits, cada un, per una visera i, en l'altre, un penell (que l'orienta sempre segons el vent dominant). Aixecant les viseres dels marcs es poden encaixar la superfície que interceptarà les partícules aerotransportades, un filtre preparat amb cinc plecs de gasa hidròfila untats amb una barreja d'oli de silicona i rodejat per un marc de plàstic. Aquest filtre és quadrat i medeix 20 cm de costat. En el captador s'exposen dos filtres: un es canvia un cop per setmana, normalment els dilluns, i l'altre s'usa com a contrapès i com a resum mensual. El filtre retirat del captador se sotmet a un tractament ^(8,1) que combina processos químics (àcids sulfúric, fluorhídric...) amb físics (centrifugacions, decantacions...) per a obtenir un sediment format, majoritàriament, pels pòl·lens i les espores retinguts. Per a poder mesurar aquest sediment amb precisió i preparar-lo per a l'anàlisi al microscopi óptic, s'inclou en una matriu semilíquida de glicerogelatina, de la que se n'estudiarà una porció representativa. La consistència semilíquida del medi en que es troben les partícules i el fet que el tractament inclou la acetolisi ⁽¹³⁾, és a dir, la eliminació de les parts toves de la cèl·lula mitjançant una digestió química, facilita la identificació dels grans de pol·len. S'ha de senyalar, però, que algunes espores de fongs es trenquen i no poden ser estudiades amb precisió amb aquesta metodologia, ja que s'obtenen valors per dessota dels reals. Si es vol obtenir una lectura representativa d'una mostra Cour han de seguir-se les indicacions proposades al descriure la metodologia ^(14,15).

Quan es treballa amb un captador Cour, és necessari disposar d'un anemòmetre totalitzador o de recorregut de vent (vegeu figura 2), aparell dotat d'unes cassoletes, que giren impulsades pel vent, connectades a un comptaquilòmetres. Aquest aparell registra els metres equivalents a l'espai recorregut per l'aire que passa a través de les seves cassoletes. La mesura del recorregut de vent corresponent al període d'exposició d'un filtre fa possible interpretar la quantitat de pòl·lens i espores comptades per unitat de volum (es considera que els pòl·lens i espores estaven en l'interior d'un prisma que té per base el filtre de 20x20 cm² i per altura la columna d'aire que ha passat durant l'exposició).

Per a obtenir el valor de la concentració mitjana setmanal de partícules hem de fer càlculs matemàtics en els que intervenen:

• el nombre de partícules comptades (N).
• la proporció de sediment analitzat (sempre 50 micròlitres (K1)) respecte del volum total de sediment semilíquid (V) obtingut al final del tractament.
• la proporció de filtre tractat (S) respecte de la superfície total del filtre (400 cm²), ja que una part del mateix es guarda com a testimoni per si fos necessari repetir el tractament.
• la superfície de mostra analitzada al microscopi òptic. Per a calcular-la es necessita conèixer el nombre (n) de línies comptades i la seva longitud (K2) i amplada (K3) (ambdues depenen del microscopi i de l'objectiu que s'usa en la lectura). Amb aquests paràmetres es calcula la proporció analitzada respecte de tota la superfície útil de la preparació microscòpica (K4).
• el recorregut de vent registrat durant el període d'exposició (Rv).

La combinació d'aquests factors, multiplicatius i quocients segons els casos, dóna lloc a una fórmula matemàtica que, aplicada a les dades brutes corresponents a cada setmana, ens permet obtenir el valor de la concentració mitjana setmanal.

La fórmula a aplicar ⁽¹⁾ és:
Concentració mitjana setmanal = K x (N x V / n x S x Rv)

• on K és una constant que incorpora tots aquells valors fixes quan la metodologia s'aplica seguit sempre la mateixa rutina (K1 a K4).
• s'ha d'anar en compte i utilitzar les unitats de mesura oportunes (V ha d'expressar-se en micròlitres; S en metres quadrats i Rv en metres)

Per tant, els resultats que s'obtenen a partir d'un captador Cour són concentracions mitjanes setmanals de pòl·lens i espores (aquestes, com ja s'ha indicat, infraestimades per la inevitable destrucció de part d'elles durant la preparació de les mostres).

Un captador Hirst ⁽⁹⁾ (vegeu figures 3 i 4) és un mostrejador d'impacte per succió que consisteix en un aparell elèctric que aspira volums constants i coneguts d'aire i els fa impactar contra la superfície receptora. Aquesta és una cinta plàstica de 19 mm d'ample que es disposa tensada al voltant d'una peça cilíndrica anomenada tambor. Per a donar-li la capacitat d'adherir i retenir les partícules, es diposita sobre la cinta una fina película d'oli de silicona, utilitzant un pinzell. La disposició del tambor així preparat en l'interior del captador és tal que, impulsat per un mecanisme de rellotgeria, gira contínuament a raó de 2mm/hora. Això fa que les partícules impulsades contra la superfície receptora quedin retingudes de forma seqüencial. Una vegada a la setmana se substitueix la superfície receptora. La ja exposada, és tallada en els fragments corresponents a cada dia de la setmana. Cada fragment és muntat en una preparació microscòpica, tenyit i fixat i és analitzat al microscopi òptic. L'anàlisi microscòpica de les mostres procedents d'un captador Hirst es fa sobre el material tal com s'obté, és a dir, amb les partícules biòtiques plenes i junt amb altres partícules, minerals i orgàniques, cosa que pot dificultar la seva identificació però que té com a molt positiu que no fa malbé les espores de fongs. També és interessant en aquest mètode que, degut al fet que les partícules es van dipositant seqüencialment sobre una cinta que avança regularment, és possible obtenir resultats amb precisió horària, ara bé, el volum de treball afegit que això comporta fa que no sigui habitual obtenir aquests resultats.

Els resultats que s'obtenen d'un captador Hirst són concentracions mitjanes diàries de pòl·lens i espores (pòl·lens/m³ i espores/m³).

Per a obtenir aquests valors n'hi ha prou amb fer un simple càlcul matemàtic en el que intervenen com factors:

• el nombre de partícules comptades (n).
• la superfície de mostra analitzada. Per a calcular-la es necessita conèixer el nombre (n) de línies comptades i la seva longitud (K2) i amplada (K3) (ambdues depenen del microscopi i de l'objectiu que s'usi en la lectura). Amb aquests paràmetres es calcula la proporció analitzada respecte de tota la superfície útil de la preparació microscòpica (K4).
• el volum d'aire que aspira el captador, normalment 10 l/minut, que, al cap d'un dia equivalen a 14,4 m³ d'aire (K5).

Molts dels paràmetres es mantenen constants (mentre no es canviï de microscopi o d'objectiu i se segueixi una rutina de recompte), de manera que és habitual tenir-los establerts per a que la operació de conversió de les dades brutes diàries a concentracions mitjanes diàries quedi reduïda a una simple multiplicació entre una constant i el nombre de partícules detectades.

La fórmula a aplicar és:
Concentració mitjana setmanal = K x N

• on K és una constant que incorpora tots aquells valors fixos quan la metodologia s'aplica seguint sempre la mateixa rutina (K1 a K5).

El captador Hirst és el que s'ha adoptat més universalment, especialment en el continent europeu, per a l'estudi dels pòl·lens i les espores atmosfèriques desencadenants d'al·lèrgies respiratòries. En el mercat hi ha actualment dues marques comercials que fabriquen i distribueixen captadors basats en el mètode Hirst: la britànica Burkard (figura 3) i la italiana Lanzoni (figura 4 ).

Elaboració de dades aerobiològiques

L'anàlisi microscòpica de les mostres aerobiològiques dóna lloc a una relació quantificada de tàxons pol·línics (un espectre), corresponent a les dades brutes d'un dia o d'una setmana, segons s'hagi utilitzat un captador Hirst o un Cour. Aplicant els càlculs adequats a la metodologia de mostreig, aquest resultats s'expressen en unitats de concentració: pòl·lens/m³, unitats molt útils a l'hora de fer-se una idea gràfica de la mesura expressada, el nombre mig de grans de pol·len continguts en un espai cúbic d'un metre de costat, durant el període de temps que va durar el mostreig (un dia o una setmana, segons el mètode).

Per a realitzar comparacions entre les quantitats de pol·len observades i la casuística de pol·linosis detectades, són molt interessants les dades de concentracions mitjanes diàries de pòl·lens; però quan es pretén elaborar gràfics i resums resulta més interessant recorrer a altres períodes de temps, com són la setmana, períodes de deu dies, etc. (concentracions mitjanes setmanals, de deu dies, etc.).

Si es volen expressar concentracions mitjanes diàries en forma de concentracions mitjanes setmanals, de deu dies o d'altres períodes de temps, s'ha de calcular la mitja aritmètica dels set, deu o n valors de concentració mitjana diària dels dies que corresponen a la setmana, els deu dies o el període de temps escollit.

Per tal que els resultats que s'expressen resultin útils als usuaris, han d'indicar-se molt clarament, no solament en quines unitats s'expressen, sinó també a quin període de temps es refereixen. Si el període escollit és la setmana, el número d'ordre d'aquestes ha d'assignar-se d'acord amb la normativa de la Organització Internacional de Normalització, segons la qual la primera setmana de l'any és aquella que conté el primer dijous.
Els espectres diaris (mètode Hirst) o setmanals (mètode Cour) són inclosos en les bases de dades i processats adequadament per a la generació de resums corresponents a períodes de temps més llargs. Així, és freqüent que s'elaborin espectres pol·línics anuals, és a dir, relacions ordenades dels diferents tipus pol·línics identificats en una localitat al llarg de tot un any i de les quantitats registrades (suma de les concentracions mitjanes diàries o setmanals, segons metodologies). Sol incorporar-se a l'espectre el valor de la concentració màxima assolida. Aquests espectres resulten molt vàlids, no només per a identificar els tàxons amb major incidència a la localitat, sinó també per a evidenciar la variabilitat interanual de les pol·linitzacions.

Calendari pol·línic

Amb el nom de calendari pol·línic es designa una representació gràfica que resumeix la dinàmica anual dels principals tipus pol·línics d'una localitat, ordenats en funció del seu període de pol·linització.

Aquest tipus de representació, que compendia en una sola figura tota la informació aerobiològica d'una localitat, facilita la comprensió de la composició pol·línica de l'atmosfera en tot moment de l'any, informa dels pòl·lens que poden resultar més perjudicials en cada moment de l'any i destaca la importància relativa d'uns pòl·lens respecte d'atres.

Encara que un calendari pol·línic confeccionat amb les dades d'un sol any de mostreig és ja una informació molt vàlida, resulten més representatius aquells calendaris elaborats amb les dades mitjanes de diversos anys d'estudi, donat que en ells queda reflectida la variabilitat interanual causada per la meteorologia i aquella que presenten determinades espècies que alternen anys d'elevada producció pol·línica amb anys de baixa pol·linització.

Els calendaris pol·línics poden confeccionar-se de maneres molt diverses. Pel que fa a l'escala de temps, els calendaris pol·línics poden representar la dinàmica dels pòl·lens en unitats de temps que siguin mesos o setmanes, més rarament la precisió del temps és diària. Sol mantenir-se constant el fet que l'escala de temps es representi en l'eix d'abcises.

Pel que fa a l'escala del pol·len, que sol ocupar l'eix d'ordenades, els calendaris pol·línics poden representar-se amb diverses unitats de mesura del pol·len:

• Amb els valors precisos de les concentracions mitjanes del període de temps. Així, el calendari resulta ser una successió de gràfics, cada un amb la corba d'un tàxon. Aquest tipus de presentació té una avantatge, la precisió; però té també un inconvenient, la quantitat d'espai que requereix, degut al fet que hi ha alguns tàxons que assoleixen concentracions atmosfèriques molt elevades. La publicació de calendaris pol·línics d'aquest tipus consumeix força espai, cosa que, a més de complicar l'edició, crea dificultats a l'hora de comparar la dinàmica entre tàxons i d'interpretar la informació continguda.
• Amb classes de valors (categories) establerts a partir de les concentracions mitjanes del període de temps. Normalment es defineixen entre 3 i 5 categories. Seguint aquest mètode, la dinàmica anual de cada tàxon queda representada per un gràfic de dimensions similars al de la resta de tàxons. Una avantatge que ofereix aquest disseny sobre l'anterior és que permet economitzar molt l'espai i això reverteix també en destacar les tendències de cada tipus pol·línic.
• Amb conceptes relacionats amb la polinització. En aquest cas s'estableixen prèviament els conceptes d'inici de la pol·linització, període de pol·linizació principal o altres que es decideixi representar (diversos autors han proposat definicions d'aquests conceptes ^(1,18). En aquest tipus de calendari pol·línic cada tàxon queda representat por un rectangle. Dins del rectangle s'encaixen, en les àrees que corresponen segon l'època de l'any, els colors o trames que s'han elegit per a representar les diferents etapes o conceptes de la pol·linització. L'elecció d'aquest disseny ofereix les mateixes avantatges que el cas anterior; però presenta una complicació: els tàxons que inicien la seva pol·linització a finals d'any i la perllonguen fins l'any següent han de ser tractats de forma diferent als tàxons que pol·linitzen dins d'un cicle anual. Si no es fa així, les dinàmiques representades pels primers poden ser completament falses.

Xarxes aerobiològiques

En les últimes dècades la major part de les disciplines científiques s'han organitzat en xarxes, és a dir, que els diversos grups d'investigació que compartien línies comunes han acordat crear bases de dades coordinades. Aquesta forma de funcionar permet una major difusió del coneixement i possibilita optimitzar esforços. Al mateix temps que les xarxes s'obren als científics que hi contribueixen, també poden obrir-se, amb les restriccions que siguin necessàries per a no perjudicar la propietat intel·lectual, al públic en general.

Aquest plantejament en l'organització de la informació va arribar també als diversos grups d'aerobiòlegs que investigaven localment i va sorgir l'organització en xarxes aerobiològiques no només a escala nacional sinó també superior (European Allergy Network, EAN, amb seu a Viena, Austria).

Les dades que es publiquen i divulguen a través de xarxes aerobiològiques nacionals e internacionals en la major part d'Europa provenen de captadors del tipus Hirst i s'han obtingut amb mètodes de recompte estandarditzats.

A escala intranacional, multitud de països han fet esforços per a convergir en un mètode estandarditzat de mostreig atmosfèric; a escala internacional es presenten algunes diferències entre països, especialment en les rutines de recompte de les mostres.

A Espanya estan funcionant dues grans xarxes nacionals de mostreig atmosfèric, la organitzada en el sí del "Comité de Aerobiología de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica" (SEAIC) ila de la "Red Española de Aerobiología" (REA). Ambdues xarxes segueixen un protocol similar de recomptes pol·línics ^(16,17), que es fan identificant i comptant tots els grans que s'observen en quatre línies longitudinals repartides proporcionalment en la superfície de la làmina. El recompte de les espores de fongs no està tan sistematitzat ni generalitzat, malgrat comença a estendre's.

Les xarxes nacionals són possibles gràcies a la contribució de xarxes a escales menors (autonòmiques i provincials) i d'investigadors individuals que adopten les seves normes de mostreig i envien periòdicament els seus resultats a la base de dades de la xarxa nacional. De la mateixa manera, les xarxes internacionals no són més que el compendi de dades servides per les diverses xarxes nacionals.

Bibliografia

(1) Belmonte J. Identificació, estudi i evolució anual del contingut pol·línic a l'atmosfera de Catalunya i Balears. Tesi Doctoral. Universitat Autònoma de Barcelona, 1988; 1: 11-14.
(2) Mandrioli P, Comtois P, Dominguez E, Galan C, Syzdek LD, Isard SA. Sampling: Principals and Techniques. In: Mandrioli P, Comtois P & Levizzani L eds. Methods in Aerobiology, Bologna: Pitagora Editrice, 1998: 47-68.
(3) Hesselman H. Über die Verbreitungsfähigkeit des Waldbaumpollens. Medd. Skogsförsöksanst., 1919; 16: 27-60.
(4) Firbas F. über die Bestimmung der Walddichte und der Vegetation Waldloser Gebiete mit Hilfe der Pollenanalyse. Planta, 1931; 22: 109-145.
(5) Wodehouse RP. Pollen grains. Mc. Graw-Hill Book Co. Inc., New York and London, 1935: 1-574.
(6) Durham OC. The volumetric incidence of atmospheric allergens IV. A proposed standard method of gravity sampling, counting and volumetric interpollation of results. J. Allergy, 1946; 17(2): 79-86.
(7) Tauber H. A static non-overload pollen collector. New Phytol., 1974; 73: 359-369.
(8) Cour P. Nouvelles techniques de d´tection des flux et des retombées polliniques: étude de la sédimentation des pollens et des spores à la surface du sol. Pollen et spores, 1974; 16(1): 103-141.
(9) Hirst JM. An automatic volumetric spore trap. Ann. Appl. Biol., 1952; 39: 257-265.
(10) May KR. The cascade impactor: an instrument for sampling coarse aerosols. J. Sci. Instrum., 1945; 22:187-195.
(11) Perkins WA. The Rotorod sampler. Second Semiannual CML 186, Aerosol Laboratory, Standford University, California, 1957.
(12) Suarez M., Seoane JA. Estudio del contenido polínico de la atmósfera de Barcelona según un nuevo método de filtración. Collect. Bot., 1983; 14: 587-615.
(13) Erdtman G. The acetolysis method. A revised description. Sv. Bot. Tidskr., 1960; 54: 561-564.
(14) Cambon G. Rélations entre le contenu pollinique de l'atmosphère et le couvert vegetal en Méditerranée occidentale à Montpellier (France), Valencia (Espagne) et Oran (Algerie). Tesi doctoral. Université Sciences et Techniques du Languedoc. Montpellier, 1981.
(15) Gros R. Contrôle de validité des analysis sporo-polliniques. Rev. Paléobiol., 1984; vol. special: 85-95.
(16) Comité de Aerobiología de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica. Introducción en la captación e identificación de los pólenes. SEAIC-Almirall Prodesfarma: 6-9.
(17) Domínguez E, Galán C, Villamandos F & Infante F. Handling and evaluation of the data from the aerobiological sampling. Monografías REA/EAN, 1992; 1: 1-18.
(18) Belmonte J, Canela M & Hinojosa C. Paràmetres de la dinàmica aerobiològica del pol·len d'olivera a Catalunya. Butll. Inst. Cat. Hist. Nat., 2000; 68: 97-111.